ELISA實(shí)驗(yàn)全流程解析：七步完成檢測

ELISA實(shí)驗(yàn)的核心步驟包括固相包被、樣本孵育、信號放大及定量分析，以下是標(biāo)準(zhǔn)化操作流程：

1. ‌包被抗體/抗原‌

將捕獲抗體或抗原(1-10 μg/mL)用碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋，加入96孔板(100 μL/孔)，4℃過夜或37℃孵育2小時(shí)，使固相載體表面充分吸附‌。

2. ‌封閉非特異性位點(diǎn)‌

每孔加入200 μL封閉液(5% BSA或脫脂奶粉)，室溫孵育1-2小時(shí)，減少后續(xù)非特異性結(jié)合‌。

3. ‌樣本孵育‌

加入梯度稀釋的樣本或標(biāo)準(zhǔn)品(100 μL/孔)，室溫孵育1-2小時(shí)，使目標(biāo)抗原與包被抗體結(jié)合‌。

4. ‌檢測抗體反應(yīng)‌

加入酶標(biāo)一抗(夾心法)或二抗(間接法)，室溫孵育1小時(shí)，通過抗體-抗原特異性結(jié)合放大信號‌。

5. ‌洗滌‌

每孔用含吐溫的PBS洗滌3-5次，去除未結(jié)合物質(zhì)，降低背景干擾‌。

6. ‌底物顯色‌

加入HRP底物(如TMB，100 μL/孔)，避光孵育15分鐘，酶促反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物‌。

7. ‌終止與檢測‌

加入終止液(如2Mls，50 μL/孔)終止反應(yīng)，15分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀讀取450nm吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度‌。

關(guān)鍵注意事項(xiàng)

溫育時(shí)間‌：避免過長導(dǎo)致非特異性結(jié)合增加;

洗滌質(zhì)量‌：殘留洗滌液會顯著影響結(jié)果準(zhǔn)確性;

顯色控制‌：顯色時(shí)間需統(tǒng)一，避免過度反應(yīng)‌。

通過上述步驟，可完成從樣本處理到定量分析的完整ELISA檢測流程‌。

注：以上僅供參考，不作為實(shí)際數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格遵循說明或咨詢技術(shù)老師。

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