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做ELISA實(shí)驗(yàn),這些技巧少不了!

更新時(shí)間:2021-03-05    點(diǎn)擊次數(shù):2084

  做ELISA實(shí)驗(yàn),這些技巧少不了!

  介紹:

  ELISA試劑盒在國(guó)內(nèi)有許多種叫法,例如:ELISA檢測(cè)試劑盒、ELISA Kit、酶聯(lián)免疫試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒、酶聯(lián)免疫分析試劑盒、酶免試劑盒等,比較常見(jiàn)的叫法是ELISA檢測(cè)試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒等。Elisa生物試驗(yàn)是一種敏感性高,特異性強(qiáng),重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法。由于其試劑穩(wěn)定、易保存,操作簡(jiǎn)便,結(jié)果判斷較客觀等因素,已廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)檢驗(yàn)的各領(lǐng)域中。

  特點(diǎn):

  1.高效、靈敏、特異的抗體。

  2.穩(wěn)定的重復(fù)性和可靠性。

  3.吸附性能好,空白值低,孔底透明度高的固相載體。

  4.適用血清、血漿、組織勻漿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、尿液等多種標(biāo)本類(lèi)型。

  5.節(jié)省實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)。

  操作方法

  1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋?zhuān)?qǐng)按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

  2.根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來(lái)定,能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。

  3. 加樣:不規(guī)范的移液操作可能帶來(lái)誤差。

  1)空白孔,空白對(duì)照孔不加樣品,生物素標(biāo)記的抗NE抗體,鏈霉親和素-HRP,只加顯色劑A&B和終止液,其余各步操作相同;

  2)標(biāo)準(zhǔn)品孔:加入標(biāo)準(zhǔn)品50ul,鏈霉親和素-HRP50ul(標(biāo)準(zhǔn)品中已事先整合好生物素抗體,故不加);

  3)待測(cè)樣品孔:加入樣本40ul,然后各加入抗NE抗體10ul、鏈霉親和素-HRP50ul,蓋上封板膜,輕輕震蕩混勻,37℃溫育60分鐘。

  4. 配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

  5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。

  6. 顯色:每孔先加入顯色劑A50ul,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘。

  7. 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。

  8. 測(cè)定:以空白孔調(diào)零,450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。測(cè)定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

  9. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程,再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。也可以使用各種應(yīng)用軟件來(lái)計(jì)算。

  洗板方法

  一、手工洗板方法:

  甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要,重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。

  二、自動(dòng)洗板:

  如果有自動(dòng)洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。

  注意事項(xiàng)

  1.從2-8℃取出的試劑盒,在開(kāi)啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

  2.各步加樣均應(yīng)使用加樣器,并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,以避免試驗(yàn)誤差。

  3.嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行,試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。

  4.為避免交叉污染,要避免重復(fù)使用手中的吸頭和封板膜。

  5.不同批次試劑盒不能混用,如遇試劑不夠,請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系客服解決

  6.底物B對(duì)光敏感,避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。

  7.中、英文說(shuō)明書(shū)或許會(huì)有不一致之處,請(qǐng)以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。

  8.保存溫度:2-8℃。

  9.有效期:6個(gè)月(2-8℃)。

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